ImageStream system FAQ

Question 1
ImageStream system はどのようなアプリケーションに使用可能ですか？

本システムは幅広いアプリケーションに対応できるように設計されています。
例えば
● 混合細胞群中における細胞質－核トランスロケーション
● リガンドのインターナリゼーション、食作用、飲作用
● ケモカイン等で誘導される形態変化
● アポトーシス、オートファジー
● 放射線によるDNA 損傷および修復
● 分子共在性解析
● 細胞周期・マイトーシス
● FISH
● 形態に基づいた細胞分類 など

Question 2
論文はどれくらい発表されていますか？

Nature, Science 等様々なジャーナルから７０以上の論文が発表されています。
詳しくはAMNIS Publication Listをご覧ください。

Question 3
ImageStream System は独自のものですか？

本システムはフローしながらイメージングができる唯一の装置で、32 以上の米国および国際特許をカバーしています。
フローしながらのイメージングはこれまでにないものですが、本システムのもっとも大きな特徴はそのスピード、細胞あたりの情報量、高い蛍光検出感度にあります。
スピードの速さは大量な細胞のイメージングおよび大集団における統計解析を可能にし、それによって不均一な細胞集団中の出現頻度の低い細胞集団に対する解析を可能にします。
細胞あたり複数のイメージを利用することにより、形態（明視野画像）、顆粒形成（暗視野画像）、蛍光強度およびその局在に基づいた細胞集団の判別を可能にします。
高い蛍光検出感度により発現量の低いマーカーに関する解析も可能にします。

Question 4
ImageStream System は浮遊細胞と同様に付着細胞にも適応できますか？

細胞濃度、サンプル量、抗体濃度などの若干の検討は必要となりますが、付着細胞を含め従来のフローサイトメトリー用のほとんどのプロトコールが適用できます。

Question 5
ImageStream System では何色の蛍光が検出できますか？

CCD カメラ1 台あたり６色まで検出できますので、カメラを２台搭載した場合最大１２色まで検出可能です。
それぞれの画像に対して定量的形態解析、蛍光強度、蛍光局在等の約８０種類のパラメーター解析が可能で、１２色解析を行った場合１細胞あたり約１０００種類の解析データを得ることが可能です。
本システムでは従来のフローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡観察で一般的に使用されている蛍光色素を使用することが可能です。

Question 6
ImageStream System の速さはどれくらいですか？

イメージング速度はサンプル細胞濃度に依存します。
50ul 中に10⁶ 個の細胞が含まれる場合、１秒間に１０００個の細胞のイメージを取得することが可能です。
本システムは１秒間に最大１００００個のイメージを取得することが可能です。サンプル交換の際の所要時間は１分間です。
この１分間で流路洗浄を行い、サンプル間のキャリーオーバーは0.1%以下です。

Question 7
サンプルあたり細胞の最低量はどれくらいですか？

本システムはサンプル５０ul のうち半分以上を使用しますので、サンプル中の細胞が１００００個と少ない場合でも、５０００個以上の細胞を取得することが可能です。

Question 8
ImageStream System で行うことをソーターと蛍光顕微鏡を利用してできないのでしょうか？

イメージングのために希少な細胞をソーターで分取してくることは容易に思いつきます。
実際には、高純度で分取してくるためにはサンプル中の分取する細胞と他の細胞とのフェノタイプの違いを厳密に区別しなければならないために、これを完遂することは非常に困難です。
多くの場合、蛍光顕微鏡の感度や解析できる蛍光色素数に限界があるために、ソートしてきた混在する細胞の解析が困難です。
また、高純度にソートしてきたとしても、蛍光の漏れこみによって正確に多色解析することは難しいものになります。
限られた色素を用いることによってこれらの問題を解決したとしても、観察できる細胞数には限界があり十分な統計データを得ることは不可能です。
少数の細胞で細胞間の多様性を議論した場合、大量の細胞から明らかになるはずの差を隠してしまう可能性があります。
ソーティング後の顕微鏡観察に伴う難しさを完全に理解するためには、本システムにおけるデータ取得および解析プロセスと対比することで容易に理解することが可能です。
本システムのプロセスは下記のとおりとなります。
フローした細胞はバックグラウンドがない中で隣接する細胞と重なることなく焦点が調整されます。また、その焦点は細胞から細胞に移る際に維持されます。

• フローした細胞のデジタル画像は極めて高感度で取得されます。
• それぞれの細胞に対して蛍光強度、局在、細胞の大きさ、形態が自動的に検束されます。
• リアルタイムで計測されたパラメーターをユーザーが要望するパラメーターと比較して合致するもののみ保存します。
• 100 万個以上のユーザーが要望する個数の細胞を保存できます。
• 蛍光漏れこみ補正はすべてのイメージのピクセルごとに比較することにより行われます。
• IDEAS ソフトウェアではそれぞれの細胞に対して形態、サイズ、蛍光強度、局在に関する1000 個以上のパラメーターに関して計測します。
• 関心のある細胞集団はIDEAS において計測されたパラメーターに基づいて作成されたプロットやヒストグラム上で同定できます。
• 関心のある細胞集団を統計的に処理することにより、サンプル間のわずかな差に関しても検出することが可能です。

• 蛍光シグナルが望む細胞に限局していない場合、高純度での精製は不可能です。
• 蛍光シグナルが暗い場合、ソーターは自家蛍光との判別が不可能になり、純度の低下につながります。
• 不均一な細胞集団中でのマーカーシグナルが暗い場合、蛍光顕微鏡においてそのマーカーを検出することは難しくなります。
• 多くのチャンネルを使用してソートした場合、蛍光顕微鏡のチャンネル数が足りなくなる可能性があります。
• ソーターで要求される表面抗原マーカーが望んでいる細胞内染色と合致しない場合、顕微鏡観察の前に再度染色する必要があります。
• 蛍光顕微鏡観察の速度が十分でない場合、統計解析に必要な個数の細胞観察が不可能になります。
• 解析ソフトが大量の細胞解析に対応していない場合、望んでいる細胞数の統計処理が不可能となります。
• それぞれの細胞において蛍光の漏れこみがあった場合、正確なデータを得ることはできません。

Question 9
EDF とはどのような機能ですか？

EDF とはExtended Depth of Field の略で、本システムにおいて細胞全体に焦点が合うようにする機能です。
EDFはFISH におけるスポットカウントの際に威力を発揮しますが、他の解析においても有用な機能です。
EDF 機能を使用することにより、スピードや感度を犠牲にすることなく、共焦点観察に近い画像を得ることが可能になります。
そのことにより、より正確なデータ解析を可能にします。

Question 10
何機のレーザーが搭載可能ですか？

本システムは100 mW 出力488nm レーザーを標準装備しております。
その他オプションとして高出力（150 mW）488nm レーザー、658nm レーザー、405nmレーザー、561nm レーザー、594nm レーザーを用意しており、最大5 本まで搭載することが可能です。

Question 11
専任のオペレーターは必要ですか？

研究室内に使用法を十分に理解して、ほかの人に教えることができる人がいれば十分です。
本システムの操作法は数時間、解析ソフトの使用法は１，２日あればマスターできます。

Question 12
最大どれくらいの大きさの細胞を観察することが可能ですか？

標準装備の40 倍対物レンズを使用した場合のチャンネル幅は60μm です。20 倍の場合120μm、60 倍の場合40μm となります。
長い物質は縦長の方向に流れるように流圧が設定されていますので、細胞の幅に依存します。

Question 13
細胞塊は問題になりますか？

本システムの流路は一番狭いところで250 ミクロンあり、すべての溶液はシリンジポンプ経由で流出しますので、流路が詰まることは稀です。
より安全な操作を保障するために、AMNIS 本社ではフローする前にサンプルを40 から70 ミクロンのフィルターに通すことを推奨しております。

Question 14
細胞が回転することはないですか？

本システムの流路系は層流で波打つことはないので、細胞が回転することはありません。

Question 15
ImageStream System で生細胞の観察は可能ですか？

本システムの流圧は低くなっていますので、まったく問題ありません。
ただし、フロー中の温度コントロール等はできませんので、その点は留意してください。

Question 16
SpeedBead は何のために使用するのですか？またそのコストはどれくらいですか？

SpeedBead はサンプルと同時に流すためのポリスチレン製の微小ビーズです。
本ビーズは機器のキャリブレーションに使用するとともに、サンプルと同時にフローすることで流速および焦点調整のリアルタイムでの監視に使用されています。
また、そのコストは1 サンプルあたり200 円程度です。

Question 17
シース液は他社のフローサイトメーター用のものを使用できますか？

シース液は本システム専用のシース液または通常のPBS を使用してください。
他社のシース液には微量の界面活性剤が含まれているものがあり、気泡発生の原因になりますので使用しないでください。
本システムで使用するCleanser、脱気剤、滅菌剤に関しては一般的に市販されているものが使用可能です。

Question 18
Time Delay Integration (TDI)とはどういうものですか？

TDI とは高速に移動している被写体に対する感度を向上させるためのCCD カメラの機能の一つで、流路を移動している細胞に対してカメラで電気的に流し撮りすることです。
細胞が被写界を下りていくのにつれて、CCD カメラのチップ内の光電子も下りていきます。
この過程は細胞の流速を測定すると同時に光電子の移動の速度も調整することで同期されています。

Question 19
IDEAS ソフトのデータは他のフローサイトメトリー解析ソフト用に出力できますか？

IDEAS で算出された数値データはテキストファイル形式またはWindows クリップボードとしてエクスポートすることが可能です。
また、プロット等はFCS ファイルとして出力可能ですが、多くの解析ソフトは画像ベースの解析をすることができません。
グラフ、解析データ等はすべてWindows クリップボードにコピーすることができます。

Question 20
イメージデータはほかの解析ソフト用に出力できますか？

IDEAS で解析した画像は16bit TIFF ファイルとして出力することができます。

Question 21
IDEAS ソフトウェアはカスタマイズすることは可能ですか？

IDEAS で計測されたパラメーターは広範囲でカスタマイズすることが可能です。
例えば、DNA 結合色素で染色した場合、明視野画像で得られた画像は細胞全体のイメージとして認識し、染色された領域以外を細胞質として定義することが可能です。
一度定義してしまえば、以降の解析に標準装備されたパラメーターと同様に処理することが可能になります。

Question 22
解析には特別なPC が必要になりますか？

IDEAS ソフトはWindows VISTA またはXP 上で起動します。
また、最低4GB のRAM と1280 x 1024 の画面解像度、データ出力のためのDVD ドライブ（またはモバイルHD 等の大容量メモリー）、データ送信のためのGbit レベルのethernet を推奨します。RAM は大きいほど、取り込み数の多いサンプルの解析が容易になります。
また、画面解像度が大きいほど、より多くのグラフや画像をモニター上に表示することが可能になります。
また、ワークステーションに付属している1TB のRAID は最初の1 年間のデータ保存に十分な容量になっています。

Question 23
データファイルの大きさはどれくらいですか？

10,000 個の細胞を取り込んだ場合、Raw データファイル、プロセスデータファイルを合わせると約500MB のサイズになります。

Question 24
ImageStream System はAPPLE コンピューターに対応していますか？

システム操作ソフトINSPIRE はWindows PC のみに対応しています。
IDEAS ソフトはINTEL ベースのAPPLE コン ピューターで稼動するかもしれませんが、テストはしておらず、サポートもしておりません。